Nov 22, 2023
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Volume de Biologia da Comunicação
Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 1157 (2022) Cite este artigo
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A descoberta de anticorpos baseada em imunização é prejudicada pela escassez de células B específicas para o antígeno. Identificar essas células é como encontrar uma agulha no palheiro. As tecnologias atuais e emergentes, embora eficazes, são limitadas em termos de captura do repertório específico do antígeno. Relatamos a purificação em massa de células B específicas do antígeno e os benefícios que ela oferece a várias plataformas de descoberta de anticorpos. Usando cinco antígenos diferentes, mostramos taxas de acerto de 51 a 88%, em comparação com cerca de 5% com métodos convencionais. Também mostramos que esta purificação é altamente eficiente com perda de apenas cerca de 2% de células específicas do antígeno. Além disso, comparamos clones nos quais as cadeias cognatas são preservadas com aquelas de bibliotecas de exibição nas quais as cadeias de células B totais (TBC) ou células B específicas do antígeno (AgSC) sofreram pareamento combinatório. Descobrimos que clones pareados de cadeia cognata e clones combinatórios da biblioteca AgSC apresentaram maior frequência de clones funcionais e apresentaram maior diversidade de sequência e parátopo em comparação com clones da biblioteca TBC. Essa técnica de seleção de células B específicas para antígenos exemplifica uma melhoria de processo com tempo de ciclo e custo reduzidos, removendo clones indesejados antes da triagem e aumentando a chance de capturar clones funcionais desejáveis e raros no repertório.
Monoclonal antibodies as a promising therapeutic modality are now widely accepted. As of now there are 129 antibody therapeutics approved or under review in the US and EU1, (August 17, 2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR2" id="ref-link-section-d65862886e640"> 2. A revelação do grupo de Dennis Burton de que os anticorpos derivados da clonagem de células B tinham maior potência terapêutica em comparação com aqueles derivados de bibliotecas combinatórias de pacientes convalescentes com HIV3, levou a um aumento nos esforços para descobrir anticorpos terapêuticos de animais imunizados ou pacientes convalescentes4,5 ,6,7,8,9,10,11,12. No entanto, a descoberta de anticorpos de animais imunizados ou pacientes convalescentes é um processo intrincado devido à escassez de células específicas do antígeno em uma vasta diversidade do repertório geral de anticorpos. A frequência de células antígeno-específicas, mesmo após uma reação imune robusta, é apenas entre 0,01–0,1% do total de células B13,14,15. Isso cria um desafio formidável, mesmo para as plataformas de triagem mais avançadas, para explorar todo o repertório imunológico. Portanto, as plataformas que dependem da imunização de animais ou do uso de células B de pacientes convalescentes lidam com uma enorme abundância de células irrelevantes, levando a um alto atrito entre a triagem e a identificação de acertos específicos do antígeno. Uma abordagem popular para o repertório imunológico de tela profunda é criar bibliotecas de fagos imunizados, várias das quais foram relatadas como uma boa fonte de anticorpos potentes16,17,18. No entanto, durante a construção de bibliotecas de exibição imune, pares de cadeias cognatas da pequena porcentagem de células específicas de antígenos sofrem extenso pareamento combinatório com o vasto repertório de cadeias de células não específicas de antígenos19. Apesar de tais pareamentos combinatórios, o pareamento cognato parental é provavelmente retido em baixa frequência18. Nossa hipótese é que aumentar a frequência dos pareamentos de cadeias cognatas parentais construindo e filtrando a biblioteca imunizada gerada a partir de células B específicas do antígeno (AgSC), poderia fornecer maior sucesso na mineração do repertório específico do antígeno.
As células B específicas do antígeno são comumente isoladas por seleção de células ativadas por fluorescência (FACS)6,7,8,9,10,11,12,20,21. Embora a citometria de fluxo funcione bem para clonagem de células B únicas, seu uso para isolamento em massa é limitado por sua velocidade e pelo efeito severo que o campo eletromagnético pode ter na integridade celular em alta velocidade de triagem22, levando a perda significativa de quantidade e qualidade celular23. Portanto, métodos suaves, mas eficientes, para isolar AgSC de animais imunizados são necessários para interrogar o repertório imunológico profundo e amplo. Desenvolvemos uma técnica de seleção em massa de células B (MBC) de memória específica de antígeno simples, mas poderosa, para identificação rápida e eficaz de IgGs monoclonais de camundongos imunizados. Esta técnica é baseada no fato de que os MBCs expressam IgGs de superfície, e a triagem de células assistida por nanopartículas magnéticas (MACS) pode ser empregada para selecionar MBCs específicos para antígenos rapidamente sob condições brandas usando antígenos biotinilados.
About eight to ten-week-old Trianni mice (HHKK) (Trianni, San Francisco, USA) (2018)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR42" id="ref-link-section-d65862886e2166"42 were used in all studies. All experiments were approved and conducted according to the guidelines of Sanofi Genzyme Institutional Animal Care and Use Committee. Mice were immunized with 50 µg of antigen in adjuvant (Sigma, catalog no. S6322) by intraperitoneal injection, and booster immunizations were performed for four to six times in two-week intervals. Sera were collected after third and last immunization to assess the antibody titers. The mice were rested for three weeks and boosted three days before harvesting secondary lymphoid tissues for processing B cells for antigen selection./p> Binding with the target antigen was also tested through a cell-based assay, wherein, phage supernatants (50 µl) from individual colonies as used for ELISA, were incubated with wild type CHO cells and CHO cells expressing antigen D on the cell surface (30,000 cells/well) for 1 hr at RT. Cells were then washed three times with PBS-BSA-1% and further incubated with 50 µl/well of pre-conjugated mouse anti-M13 antibody (1:500 dilution) and Alexa-647 labelled anti-mouse antibody (1:200 dilution) (Invitrogen, catalog no. A28181) in dark at RT for 1 hr. Cells were then washed thrice with PBS-BSA-1%, suspended in 100 µl of PBS-BSA-1% and acquired in an iQue flow cytometry system (Sartorius) to evaluate binding of individual samples. The data was analyzed using Forcyte software (2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR43" id="ref-link-section-d65862886e3135"43. Irrelevant Fab expressing negative control phage particles were also used as controls./p>