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Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 1157 (2022) Cite este artigo

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A descoberta de anticorpos baseada em imunização é prejudicada pela escassez de células B específicas para o antígeno. Identificar essas células é como encontrar uma agulha no palheiro. As tecnologias atuais e emergentes, embora eficazes, são limitadas em termos de captura do repertório específico do antígeno. Relatamos a purificação em massa de células B específicas do antígeno e os benefícios que ela oferece a várias plataformas de descoberta de anticorpos. Usando cinco antígenos diferentes, mostramos taxas de acerto de 51 a 88%, em comparação com cerca de 5% com métodos convencionais. Também mostramos que esta purificação é altamente eficiente com perda de apenas cerca de 2% de células específicas do antígeno. Além disso, comparamos clones nos quais as cadeias cognatas são preservadas com aquelas de bibliotecas de exibição nas quais as cadeias de células B totais (TBC) ou células B específicas do antígeno (AgSC) sofreram pareamento combinatório. Descobrimos que clones pareados de cadeia cognata e clones combinatórios da biblioteca AgSC apresentaram maior frequência de clones funcionais e apresentaram maior diversidade de sequência e parátopo em comparação com clones da biblioteca TBC. Essa técnica de seleção de células B específicas para antígenos exemplifica uma melhoria de processo com tempo de ciclo e custo reduzidos, removendo clones indesejados antes da triagem e aumentando a chance de capturar clones funcionais desejáveis ​​e raros no repertório.

Monoclonal antibodies as a promising therapeutic modality are now widely accepted. As of now there are 129 antibody therapeutics approved or under review in the US and EU1, (August 17, 2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR2" id="ref-link-section-d21906725e640"> 2. A revelação do grupo de Dennis Burton de que os anticorpos derivados da clonagem de células B tinham maior potência terapêutica em comparação com aqueles derivados de bibliotecas combinatórias de pacientes convalescentes com HIV3, levou a um aumento nos esforços para descobrir anticorpos terapêuticos de animais imunizados ou pacientes convalescentes4,5 ,6,7,8,9,10,11,12. No entanto, a descoberta de anticorpos de animais imunizados ou pacientes convalescentes é um processo intrincado devido à escassez de células específicas do antígeno em uma vasta diversidade do repertório geral de anticorpos. A frequência de células antígeno-específicas, mesmo após uma reação imune robusta, é apenas entre 0,01–0,1% do total de células B13,14,15. Isso cria um desafio formidável, mesmo para as plataformas de triagem mais avançadas, para explorar todo o repertório imunológico. Portanto, as plataformas que dependem da imunização de animais ou do uso de células B de pacientes convalescentes lidam com uma enorme abundância de células irrelevantes, levando a um alto atrito entre a triagem e a identificação de acertos específicos do antígeno. Uma abordagem popular para o repertório imunológico de tela profunda é criar bibliotecas de fagos imunizados, várias das quais foram relatadas como uma boa fonte de anticorpos potentes16,17,18. No entanto, durante a construção de bibliotecas de exibição imune, pares de cadeias cognatas da pequena porcentagem de células específicas de antígenos sofrem extenso pareamento combinatório com o vasto repertório de cadeias de células não específicas de antígenos19. Apesar de tais pareamentos combinatórios, o pareamento cognato parental é provavelmente retido em baixa frequência18. Nossa hipótese é que aumentar a frequência dos pareamentos de cadeias cognatas parentais construindo e filtrando a biblioteca imunizada gerada a partir de células B específicas do antígeno (AgSC), poderia fornecer maior sucesso na mineração do repertório específico do antígeno.

As células B específicas do antígeno são comumente isoladas por seleção de células ativadas por fluorescência (FACS)6,7,8,9,10,11,12,20,21. Embora a citometria de fluxo funcione bem para clonagem de células B únicas, seu uso para isolamento em massa é limitado por sua velocidade e pelo efeito severo que o campo eletromagnético pode ter na integridade celular em alta velocidade de triagem22, levando a perda significativa de quantidade e qualidade celular23. Portanto, métodos suaves, mas eficientes, para isolar AgSC de animais imunizados são necessários para interrogar o repertório imunológico profundo e amplo. Desenvolvemos uma técnica de seleção em massa de células B (MBC) de memória específica de antígeno simples, mas poderosa, para identificação rápida e eficaz de IgGs monoclonais de camundongos imunizados. Esta técnica é baseada no fato de que os MBCs expressam IgGs de superfície, e a triagem de células assistida por nanopartículas magnéticas (MACS) pode ser empregada para selecionar MBCs específicos para antígenos rapidamente sob condições brandas usando antígenos biotinilados.

50,000 paired reads per pool and the sequence analysis was performed using our internal analysis tool. For our analysis, we only used the sequences that were observed at least twice in the sequencing run. We identified a total of 2000 unique VH sequences in the AgSC library and 2033 unique VH sequences in the TBC library pools. Although, antigen-specificity of these clones were not verified, the dominant gene families observed in the Sanger data (IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-46, IGHV3-11, IGHV3-33, and IGHV4-34) were similarly represented in the NGS data (Supplementary Fig. 2). Similar to the Sanger data, we observed a high representation of IGHV3-11 gene family in the NGS data among the AgSC samples (206) in comparison to the TBC clones (121). On the contrary, the gene families IGHV4-34 and IGHV6-1, which were not represented among the AgSC clones in the Sanger data, were observed in the NGS dataset. Additionally, several new gene families (IGHV1-2, IGHV1-8, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV3-48, IGHV3-7, IGHV4-39, IGHV4-59, IGHV5-51) that were not observed in the Sanger data among both the libraries, were observed at a minor level in the NGS dataset (Supplementary Fig. 2). Since the Sanger sequencing was done with antigen specific clones while the NGS was done with the total eluate from panning rounds, it is possible that these sequences represent non-specific background phage. It is also possible that they are low frequency sequences not represented among the samples investigated for antigen specific screening and Sanger sequencing./p> 50 °C for all clones (Supplementary Fig. 4). We did not observe a significant difference in the thermal stability of Fabs from clones of either libraries against the antigen C or D (Supplementary Fig. 4a, b)./p>

About eight to ten-week-old Trianni mice (HHKK) (Trianni, San Francisco, USA) (2018)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR42" id="ref-link-section-d21906725e2166"42 were used in all studies. All experiments were approved and conducted according to the guidelines of Sanofi Genzyme Institutional Animal Care and Use Committee. Mice were immunized with 50 µg of antigen in adjuvant (Sigma, catalog no. S6322) by intraperitoneal injection, and booster immunizations were performed for four to six times in two-week intervals. Sera were collected after third and last immunization to assess the antibody titers. The mice were rested for three weeks and boosted three days before harvesting secondary lymphoid tissues for processing B cells for antigen selection./p>95% on the day of transfection. Cell suspension (0.5 ml) was prepared to a final density of 3 × 106 cells/ml with Fresh Expi293 media into each well of 96-deep well culture plate (Fisher Scientific, catalog no. 07-000-873). Paired IgG1 heavy and kappa chain linear expression cassettes (LECs) were mixed (500 ng each) in 50 µl of Opti-MEM I medium. Separately, 5 µl ExpiFectamine 293 Reagent (Fisher Scientific, catalog no. A14524) was diluted in 50 µl of Opti-MEM (Fisher Scientific, catalog no. 31985062). The diluted ExpiFectamine 293 Reagent was then mixed with the DNA mix and incubated for 20 min at room temperature. This transfection mix was added to the Expi293F cell suspension in each well of the culture plate and mixed gently. The culture plate was sealed with porous Aeraseal film (Sigma Aldrich, catalog no. A9224-50EA) and incubated at 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. After 18 h, a cocktail of Enhancer I and II (comes with the ExpiFectamine 293 Reagent kit; 5 µl of Enhancer 1 and 50 µl of Enhancer 2) was added to each well. The cells were incubated for another 120 h in 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. Cell culture supernatant was harvested by centrifuging the culture plates at 1000 g for 30 min and the supernatants were transferred to Matrix 96-well storage tubes (Fisher Scientific, catalog no. 50-823-846). Antibody concentration in the culture supernatant was measured by Octet (ForteBio) and specific binding to the target antigen was tested by ELISA./p>

Binding with the target antigen was also tested through a cell-based assay, wherein, phage supernatants (50 µl) from individual colonies as used for ELISA, were incubated with wild type CHO cells and CHO cells expressing antigen D on the cell surface (30,000 cells/well) for 1 hr at RT. Cells were then washed three times with PBS-BSA-1% and further incubated with 50 µl/well of pre-conjugated mouse anti-M13 antibody (1:500 dilution) and Alexa-647 labelled anti-mouse antibody (1:200 dilution) (Invitrogen, catalog no. A28181) in dark at RT for 1 hr. Cells were then washed thrice with PBS-BSA-1%, suspended in 100 µl of PBS-BSA-1% and acquired in an iQue flow cytometry system (Sartorius) to evaluate binding of individual samples. The data was analyzed using Forcyte software (2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR43" id="ref-link-section-d21906725e3135"43. Irrelevant Fab expressing negative control phage particles were also used as controls./p> (August 17, 2020)./p> (2018)./p> (2020)./p>